米国バージニア大学医学部薬理学教室からの報告である。延髄腹外側に存在する後台形核retrotrapezoid nucleus（RTN）には，CO₂/H⁺を感知して脳幹の呼吸リズムを制御する神経があり，難病として知られる先天性中枢性低換気症候群（https://www.nanbyou.or.jp/entry/3359）は転写因子PHOX2Bの変異によるRTN神経の機能異常で無呼吸やCO₂感受性の低下を発症することが知られる。この研究ではCO₂/H⁺を化学受容する神経にはPhox2b以外にもNmb，Pacapが発現することが知られ，特にPACAPは乳幼児突然死症候群（SIDS）で変異が関連し，そのノックアウトマウスは無呼吸やCO₂による呼吸刺激応答が低下し，SIDS様の表現型を呈することに着目した。

　まず，研究者たちはRTN神経でのPacapの役割を調べるため，Phox2bの遺伝子発現に合わせてCreを発現するマウスを用いることでRTN神経のみでPacapを遺伝子欠損するコンディショナルノックアウト（cKO）マウスを作出したところ，CO₂による呼吸刺激が抑制され，無呼吸の頻度が増加することを確認した（Fig 1）。一方で低酸素による呼吸刺激では応答性は変化なかった。また，レンチウイルスを使ってPacapの遺伝子発現を復活させる実験も行って，CO₂による呼吸刺激応答が回復して無呼吸の頻度が戻ることも確認したり，RNA干渉によりPacapの発現を抑制するためのshRNAを載せたレンチウイルスに感染させる実験も行って念入りに調べている。in vitroの実験も行い新生仔マウスの脳スライスを用いて，Pacapの欠損に伴うpH変動時の神経刺激には影響はないことや，記録をとった後の神経細胞から1細胞レベルの定量的PCRを行ったりして遺伝子発現への影響も調べ，Pacapの欠損後もRTN 神経はCO₂/H⁺への応答は維持すること，Pacapの受容体であるPac1はRTN神経には5％未満にしか発現していないことを確認した。

　次にCO₂による呼吸刺激応答におけるPacapの役割とPac1陽性のRTN神経細胞の化学受容の関係性を調べた。レンチウイルスを感染させたmCherryのRTN神経は呼吸リズムを制御するpre-Bötzinger complex（preBötC）内のSomatostatin陽性神経細胞周辺に伸びていることがわかるが，Pac1やCO₂で誘導されるFosの発現がこれらの神経細胞内に認められる。Pacapの発現を抑制したり欠損させるとpreBötC内のFosの発現は強く抑制されたので，RTNに発現したPacapはpreBötC内のPac1陽性神経細胞を介して呼吸に影響すると考えられた。さらにpreBötCにPacapを直接注入すると呼吸回数が刺激されることをin vivoと脳スライスを用いたin vitroの両方で確認した（Fig 2）。

　さらに研究者たちはpreBötC におけるPac1がPacapの呼吸刺激効果に関与しているか調べるため，レンチウイルスに載せたshRNAを用いてPac1をノックダウンしたところ，PACAP1の効果が打ち消され，無呼吸の頻度も増加することを確認した。CO₂による刺激ではPac1欠損マウスのpreBötCではFos発現細胞の数が抑制されることも確認しており，Pacap1欠損時と同様の結果だった。最後にこの論文で一番重要なところだが，研究者たちはPac1の発現量は発生の過程で成体まで変わらない一方で，Pacapはマウスが生まれるE19.5まで低いレベルだったのが，出生後P0〜P3にかけて急激に増加し，その後成長するにつれてに徐々に低下していくことを発見した（Fig 4）。

　そこでE17.5〜E19.5にかけてマウスから胎仔を取り出して呼吸させ，時間経過を追ってin situ hybridizationと1細胞レベルの定量的PCRで確認したところ，E17.5でも呼吸を始めると，Pacapの発現は子宮内に残した胎仔と比べて，明らかに上昇しており，出生後の呼吸開始に際して外気に触れた瞬間から急激に発現上昇することがわかった。そしてこの現象をPacapのcKOマウスを使って出生2〜12日後（P2〜P12）でCO₂で呼吸を刺激したところ，1回換気量や呼吸回数は50％以上も抑制され，無呼吸頻度は増加した。さらに気温を38℃，30℃，24℃，22℃で設定して無呼吸頻度を比較したところ，PacapのcKOマウスでは30℃を境に気温が高くても低くても無呼吸頻度は著しく増加することがわかり，RTN神経におけるPacapの発現は，新生仔マウスが気温変化があっても正常に呼吸するために保護的に働くことがわかった。研究者たちは乳幼児突然死症候群（SIDS）で見つかったPacapの遺伝子多型についても言及し，CO₂感受性のRTN神経細胞において出生時に急激に発現上昇するPacapは，出生後の呼吸制御に重要な役割を果たしていると結論付けた。ちなみにPacapは1989年に現鹿児島大学の宮田篤郎教授が故有村章博士が所長をされていた米国テュレーン大学日米協力生物医学研究所研究室で発見したペプチドホルモンである。現在に至るまでに，精神行動との関係性や，片頭痛の治療標的としても臨床治験が進められていることから非常に多彩な役割を担ったホルモンと考えられる。

　ニューヨークのMemorial Sloan Kettering Cancer Centerからの報告である。ナイーブT細胞がエフェクターT細胞に分化するときに細胞内代謝経路が変更されることが知られていて，解糖系で重要な役割を果たす乳酸脱水素酵素の1つであるLDHAはエフェクターT細胞のサイトカイン発現を促進することがわかっているが，感染時に解糖系がどうやってエフェクターT細胞を制御するかはわかっていなかったのでそれを明らかにした論文である。このような代謝の変化はがん細胞に認められるWarburg効果に類似していることにも言及している。実験モデルには免疫研究でよく利用されているエピトープであるovalbumin（OVA）を強制発現したリステリア菌をマウスに感染させ，マウスMHCクラスI（H-2K^b）のOVA陽性エフェクターT細胞を単離したところ，CD8⁺ナイーブT細胞に比べて最大で5倍のLDHAが発現していた。そしてナイーブT細胞を抗CD3抗体で活性化すると，用量依存的にPI3Kによってリン酸化を受けるAktのリン酸化がLDHAとその転写調節因子であるc-Mycと共に増加することを見出した。

　そこで研究者たちはエフェクターＴ細胞におけるLDHAの役割を調べるためにTbx21（T-bet）にCreを発現させたマウスを使ってMHCクラスIのOVA陽性エフェクターT細胞においてLDHAを欠損させたコンディショナルノックアウト（KO）マウスを作出したところ，この細胞集団は脾臓からごくわずかしか検出されなくなり，リステリア菌が排除されなくなった（Fig 1）。

　次にCD8陽性Ｔ細胞にOVA特異的なTCRを発現するトランスジェニックマウスであるOT-Iマウスと上述のKOマウスを交配し，LDHA欠損の有無をマウス系統でCD45を抗体で区別できるようにしてOVA感受性のCD8陽性Ｔ細胞を野生型マウスに移植して，OVA発現リステリア菌を感染させる競合試験を行ったところ，LDHA欠損CD8陽性T細胞は野生型に比べて増殖能が低く，活性や分化能も低下していた。LDHA欠損T細胞ではAktやFoxo1のリン酸化も低下していたので，メカニズムを調べるためリン酸化されない変異型Foxo1を発現するマウスを利用したところ，MHCクラスIのOVA陽性エフェクターT細胞はLDHA欠損時と同様にわずかしか検出できなくなった（Fig 2）ことからLDHAはCD8陽性エフェクターT細胞におけるAkt-Foxo1シグナルを促進すると考えられた。

　次に研究者たちはナイーブT細胞でのLDHAを欠損させるため，CD4陽性細胞でLDHAを欠損させたマウスを作出したところ，ナイーブT細胞でのAkt-Foxo1には影響が及ばなかったが，抗CD3抗体と抗CD28抗体で活性化したLDHA欠損T細胞ではAktとFoxo1のリン酸化が減少しており，AMPKαのリン酸化が亢進していた。抗原感作したLDHA欠損Ｔ細胞でのATP産生の減少がAkt-Foxo1シグナルの低下をもたらすのか，ストレプトリジンＯで細胞に穴をあけてATPを添加するとAkt-Foxo1シグナルはLDHA欠損下でも回復した。また，PIK3によって産生されるPIP3について調べたところ，LDHA欠損T細胞ではPIP3は低値で，ストレプトリジンＯで細胞に穴をあけてATPを添加するとPIP3の産生は回復した。LDHAはピルビン酸を乳酸に変えて細胞質内のNAH⁺を再産生して解糖系ATP産生を進める。LDHA欠損T細胞ではNAD⁺/NADH値が低く，細胞外に排出される水素イオン濃度（細胞外酸性化速度：解糖系）が低い一方で細胞の酸素消費（酸素消費速度：ミトコンドリア呼吸）は高くなっており，細胞外フラックスアナライザーを用いて，野生型とLDHA欠損T細胞を比較した。

　結論として，ナイーブT細胞はミトコンドリア呼吸に，エフェクターT細胞は解糖系で産生させるATPに依存し，特に解糖系ATP産生はLDHAに依存していることを明らかにした。

　今週号はCOVID-19外来患者を対象とした中和抗体の臨床治験の中間報告が2件掲載されており，1つはリジェネロン・ファーマシューティカルズ社が開発するSARS-CoV-2に対する中和モノクローナル抗体のカクテル製剤（REGN-COV2），もう1つはイーライリリー社が開発するモノクローナル抗体製剤（LY-CoV555）である。両論文ともまだ進捗の報告程度に過ぎず，ウイルス量を減らす効果や安全性などについて確認したという内容にとどまっているため，今後の治験結果が正式にまとまるのを待ちたい。米国ではすでに両製剤とも条件付きで緊急使用許可が出ており，LY-CoV555についてはまさに本稿を準備している1月21日付で介護施設を対象とした研究でCOVID-19の発症を80%予防したというプレスリリースがイーライリリー社から出されたところである（リンク）。論文を待たずに次々進展していく新型コロナ関連の情報には常に注意を払っておく必要があるが，本稿ではあえてCRISPR-Cas9による臨床治験についてマイルストーンとも言える最初の論文報告が出ていたので，今後領域を問わず様々な疾患に応用されていくであろうCRISPR-Cas9の可能性に期待して取り挙げることにした。

　新しい治療技術はまず最も効果が期待できる対象疾患・条件に限定して安全性や薬効が評価され，その後適応が拡大されていく。CRISPR-Cas9によるゲノム編集技術が2020年のノーベル化学賞を飾ったことは記憶に新しいが，複数の企業がすでに様々な疾患を対象に臨床治験を開始している。今回の治験は開発企業が，1年前の2019年12月には査読を経ない形では臨床データを公表しており（リンク），すでに期待は高まっていた。鎌状赤血球症とβサラセミアの患者1名ずつの症例報告で今後の症例集積が必要なことは予め断っておくが，少なくともこの症例での治療効果は確かなものだったようである。Editorialにも取り挙げられている（リンク）。

　鎌状赤血球症は世界で毎年30万人，βサラセミアは毎年6万人が診断されており，単一遺伝子疾患としては最多とされる。どちらもヘモグロビンβサブユニット（HBB）の遺伝子異常であり，前者は点変異によるアミノ酸置換によりヘモグロビンが脱酸素化時に凝集反応を起こして赤血球が変形し，溶血，貧血，痛みを伴う血管閉塞症状などを引き起こす疾患であり，後者はβグロビン産生低下や欠失により赤血球生成が障害される疾患である。いずれも頻回の輸血や鉄キレート剤による治療を必要とし，臓器障害を伴って生命予後に関わる疾患であることから，様々な治療手段の開発が進められてきた。同種骨髄移植は根治的治療として行われてきたが，HLA適合の問題があるため治療できるケースは20％未満である。最近は患者から採取した造血幹細胞に正常に機能するβグロビン遺伝子をレンチウイルスで発現させてから体内に戻す治療がEU圏では一部のβサラセミアで承認され，鎌状赤血球症についても治験が進められている。

　今回CRISPR-Cas9で標的とした遺伝子はBCL11Aという転写因子だが，もともとは疫学的な知見から見出された治療標的だ。ヘモグロビンは通常，出生と同時に数カ月かけて胎児型から成人型へと置き換わっていくことが教科書的知識だが，胎児型ヘモグロビンが成人まで高発現するTDTやSCD患者では軽症だったり発症しないことが報告されており，関連するSNPも見つかっている。中でも胎児型ヘモグロビンを構成するγグロビンの遺伝子発現を抑制する転写因子BCL11AのSNPでは胎児型ヘモグロビンが増加することが報告されていた。研究者たちはBCL11A遺伝子の赤血球特異的に発現させるエンハンサー領域を狙ってCRISPR-Cas9でゲノム編集して遺伝子発現を抑制する戦略を立てた。それぞれの患者から採取した自家造血幹細胞に対してCRISPR-Cas9でゲノム編集して胎児型ヘモグロビンの発現が持続するように改変した細胞製剤「CTX001」を開発し，患者体内に戻す形で1回投与した。細胞製剤「CTX001」の前臨床試験では，10名の健常者由来のCD34陽性造血幹細胞でゲノム編集を行い，80±6％の高効率でゲノム編集が起きること，in vitroだけでなく免疫不全マウスを使ってin vivoでもゲノム編集の効果が4カ月後でも維持されることを確認した。また，ゲノム編集で懸念される標的部位以外（off-target）での変異の有無については2種類の方法で確認して導入されないことを確認した。

　そして臨床治験であるが，1症例目はβサラセミアの19歳女性で2年以上にわたって年に34単位の赤血球輸血を受けてきたケースである。2歳から輸血と鉄キレート剤の投与を繰り返してきたという。鉄分過剰，C型肝炎ウイルス感染歴，脾腫，頭蓋骨の壊死の既往歴があった。論文投稿段階でCTX001投与後21.5カ月間フォローされた。ゲノム編集効率68.9％の細胞が投与され，末梢血と骨髄でゲノム編集効率がフォローされたが，18カ月にわたって維持された。胎児型ヘモグロビンは0.3g/dLだったのが，3カ月後には8.4g，12カ月後は12.4g/dLに上昇した。治療後21.5カ月間での有害事象も報告されており，うち2件は好中球減少時に発症した肺炎と造血細胞移植後の合併症として知られる肝中心静脈閉塞症（別名：類洞閉塞症候群）を13日目に発症した。重度の有害事象とみなされたが，いずれも緩解した。赤血球輸血は細胞治療後30日目を最後に不要となり，ヘモグロビン値は正常を維持している。

　2症例目は鎌状赤血球症の33歳女性で重度の血管閉塞症状を年に平均7回発症し，2年以上にわたり年に3.5回の入院と5回の赤血球輸血を受けてきたケースである。既往歴には慢性疼痛，胆石症などがあり，CTX001投与後16.6カ月フォローされてきた。CTX001は2回に分けて製造されゲノム編集効率は82.6％と78.7％で，投与後の末梢血と骨髄血のフォローで十分に高い数値が維持されていた。ヘモグロビンは7.2g/dLだったのが，輸血なしで3カ月後には10.1g/dL，15カ月後には12g/dL（胎児型ヘモグロビンは43.2 %）にまで上昇した。治療後16.6カ月の有害事象のうち，好中球減少中の敗血症（16日目），胆石（49日目），腹痛（56日目）が重度とみなされたが，いずれも治療により緩解した。また重篤ではなかったが間欠的にリンパ球の現象を認め，CTX001投与後のT細胞の回復遅れによると考えられたが，それも351日目までには緩解した。治療効果としては観察期間中に血管閉塞症状は発症しなかったことや治療後19日目を最後に赤血球の輸血は不要になった。

　上述の２症例とも有害事象を伴ったが適切な対処で緩解しており，胎児型ヘモグロビンが増加した状態が1年後も維持され，輸血が不要になって症状も改善したのは顕著な効果と言える。まだまだこれからの治験症例の集積が必要だが今のところ期待が持てる内容だ。

（後藤慎平）